ژن‌ های دخیل در پاسخ به پروتئین های تانخورده در ماکروفاژهای مشتق از خون محیطی بیماران ایرانی مبتلا به بهجت

ژن‌های دخیل در پاسخ به پروتئینهای تانخورده در ماکروفاژهای مشتق از خون محیطی بیماران ایرانی مبتلا به بهجت

چکیده

بیماری بهجت (Behcet Disease) یک بیماری خود ایمنی با زمینه ژنتیکی است و عوامل بیماری زایی دقیق این بیماری هنوز مشخص نیست. با توجه به نقش سایتوکاین‌های پیش التهابی در بیماری زایی بیماری بهجت و نقش استرس شبکه آندوپلاسمی در تولید این سایتوکاین‌های پیش التهابی در ماکروفاژها، به نظر می رسد که اختلال در عملکرد شبکه آندوپلاسمی و فعال شدن پاسخ UPR نقش کلیدی در روند بیماری زایی این بیماری ایفا کند. به منظور اثبات این فرضیه، میزان بیان ژن‌های درگیر در استرس شبکه آندوپلاسمی در ماکروفاژهای بیماران مبتلا به بیماری بهجت اندازه گیری شد. بیان ژن­های herp ،GADD34 ، Chop،BiP ،XBP1 ،ATF4 ،ATF6  با استفاده از تکنیک Real-time PCR ارزیابی شد. بر اساس نتایج بدست امده در مطالعه حاظر به نظر می رسد ابشار پیام رسانی UPR در بروز این بیماری دخیل می باشد شاهد این مدعی تغییرات معنی دار ژن های HERP و GADD34 می باشد. سایر ژن های مسیر UPR شامل CHOP، ATF6، XBP1، ATF4 تغییرات معنی داری در افراد مبتلا به این بیماری در مقایسه با افراد سالم نشان نداند. نتایج همچنین نشان داد که مصرف سیگار بیان ژن های مسیر UPR را در بیماران بهجت افزایش می دهد که نشان دهنده نقش مسیر اکسیدانی و UPR در بروز این بیماری می باشد. هر چند آزمایشات دیگری برای اثبات این ادعا باید صورت گیرد.

کلید واژه: بیماری بهجت، UPR، بیان ژن، آبشار پیام رسانی

مقدمه

بیماری بهجت که به آن بیماری جاده ابریشم نیز می‌گویند، یک ناهنجاری مزمن، عود کننده و چند سیستمی است که یک نوع التهاب رگ‌ها محسوب می‌گردد و باعث ایجاد مشکلات بینایی، ایجاد ضایعات پوستی، دهان، پستان و دستگاه تناسلی می‌شود. در موارد نادری این بیماری همراه با مشکلات ریه، روده یا درد ماهیچه‌ها می باشد. مهم‌ترین علائم آن شامل آفت‌های پی در پی در ناحیه دهان و ناحیه تناسلی است

وقوع این بیماری بیشتر در کشورهایی که اطراف جاده ابریشم (جاده ابریشم از آسیای شرقی شروع شده و تا منطقه مدیترانه امتداد می‌یابد) قرار دارند، مشاهده می‌شود. هر چه از جاده‌ی ابریشم دور می‌شویم، وقوع این بیماری هم کمتر می‌شود و در نیمکره جنوبی به عنوان یک بیماری استثنائی محسوب می‌گردد.

بیماری­های خود ایمنی

سیستم ایمنی بخصوص عوامل خارجی را شناسایی و حذف می کند و میزابان را از در برابر الودگی محافظت می کند. در طول بلوغ سیستم ایمنی، سلول های ایمنی  که بر علیه بافت خودی واکنش می دهند در واقع سیستم ایمنی که نسبت به بافت خودی مقاومت می کند را از دست می دهند. اخیرا محققان مشخص کرده اند که خود ایمنی یک پدیده ی طبیعی با انتی بادی های خود واکنشگر بوده و سلول های خود ایمنی در هر کسی دیده می شود. ترکیبی از استعداد ژنتیکی و فاکتورهای محیطی در نمو یک بیماری خود ایمنی دخیل می باشد [۱]. با توجه به این که بسیاری از بیماری های خود ایمنی در سنین جوانی شروع می شود و در طول زندگی  ادامه می یابد این بیماری ها اثرات متناجسی در سلامت عمومی دارند بعلاوه بسیاری از بیماری های خود ایمنی بصورت حاد در طبیعت وجود دارند نیاز به مراقبت در طول زندگی دارند. فهم مکانیسم هایی که منجر به برهم خوردن تنظیم واکنش ایمنی می شود منجر به شناسایی روش های مفید در درمان می شود [۲].

کلیاتی از سیستم ایمنی

سیستم ایمنی یک سری پیچیده از مکانیسم های پروتیئن های محلول، مواد شیمیایی و سلولی می باشد که بدن را از مواد دیگر شامل سلول های توموری و عفونی بدون اسیب به مولکول های خودی محافظت می کند. تشخیص بین ملکول های خودی و غیر خودی با استفاده از مکانیسم های پیچیده ای صورت می گیرد که این سیستم به وجود مولکول های تشخیصی ویژه ای در سطح سلول های سیستم ایمنی خصوصا لمفوسیت های B و T  بستگی دارد. درصد کمی از لمفوسیت های B و T در شرایط نرمال وجود دارند. مقاومت با استفاده از برهمکنش انواع مختلفی از سلول ها و حد واسط های محلول کنترل می شود با این حال در شرایط محیطی خاص، این مقاومت بوسیله ی پاتوژن های خود ایمن شکسته می شود[۱].

بسیاری از سلول های سیستم ایمن گلبول های سفید خون می باشند که لمفوسیت ها یک نوع از انها می باشد. انواع مختلفی از لمفوسیت ها در سیستم های ایمنی که هر کدام وظیفه ی بخصوصی دارند شرکت دارد . سلول های T در شناسایی و حذف انتی ژن ها نقش دارند و سلول های B، انتی بادی هایی که هر کدام به انتی ژن های بخصوصی متصل شده و ان را برای تخریب بوسیله سلول های سیستم ایمنی نشان دار می کند[۳].

سلو های T سلول های اساسی در سیستم ایمنی می باشد که برای تخریب سلول های الوده و هماهنگی واکنش کلی سیستم ایمنی لازم می باشند [۳].

سه نوع سلول T شامل

سلول های کمکی T که سلول های B  را برای تولید انتی بادی های قویتر پیام رسانی می کنند

سلول های T کشنده که مولکول های دارای انتی ژن ها را تخریب می کنند

سلولهای T مهار کننده که دیگر واکنش های ایمنی را تعدیل می کنند.

سلول های T  در سطح خود مولکول هایی با عنوان گیرنده های سلول T دارند. این گیرنده ها با کمپلکس MHC برهمکنش می دهند. مولکول های MHC در سطح بسیاری از سلول های دیگر بدن قرار دارد و سلول های T کمکی قطعات انتی ژنی را شناسایی می کنند. سلول هایی که سلول های T را پیام رسانی می کنند سلول های دارای انتی ژن  یا APCs نامیده می شود[۴].

نقش APC (Antigen-presenting cells)

APCs ها در دو طبقه گروه بندی می شوند: حرفه ای و غیر حرفه ای

APCs حرفه ای: انتی ژن های درونی خیلی کارامد می باشد که با استفاده از فاگوسیتوز و یا با اندوسیتوز با واسطه اندوسیتوزیس و با بروز قسمتی از انتی ژن ها، به کلاس دوم از مولکول های MHC در غشای انها وصل می شوند. سلول های T تشخیص دهنده و واکنش دهنده به آنتی ژنهای کلاس دوم کمپلکس مولکولی MHC در سطح غشایی سلول های دارای انتی ژن وصل می شوند. پیام های اضافی با استفاده از آنتی ژنهای موجود در سلول منجر به فعال شدن سلول های T می شود. سه نوع APCs های حرفه ای وجود دارد: سلول های دندریتیک که دامنه گسترده ای از انتی ژن ها را دارند و احتمالا مهمترین نوع APCs می باشند، ماکروفاژها و سلول های B نوع دیکر از APCs های حرفه ای می باشند که انتی بادی های اختصاصی را ترشح می کنند[۴]

APCs های غیر حرفه ای: APCs های غیر حرفه ای بصورت اساسی پروتئین های کلاس دوم MHC را برای برهم کنش با سلول های T بیان نمی کنند. و تنها در واکنش به تحریک سیتوکین های خاصی از قبیل IFN-γ بیان می گردند. APC های غیر حرفه ای شامل فیبروبلاست ها (پوست) ، سلول های تیمیک اپیتلیال، سلول های اپیتلیال تیروئید، سلول های گلیال مغز، سلول های بتای پانکراتیک و سلول های اندوتلیال رگی[۵].

بازیگر های کلیدی دیگر در بیماری های خود ایمنی مولکول های پیام رسان شامل سیتوکین ها و چموکین ها می باشد. سیتوکین ها پروتئین هایی هستند که می توانند سلول های ایمنی را فعال کنند و روی فرایند های غیر ایمنی تاثیر می گذارند بنابراین باعث بروز التهاب و زخم می گردند. چموگین ها مولکول های کوچکی هستند که سلول های ایمنی دیگر را جذب کرده و می توانند در تهاجم و ایجاد التهاب در ارگانهای هدف نقش داشته باشند[۶].

دسته بندی بیماری های خود ایمنی

بیماری خود ایمنی ممکن است به صورت سیستمیک (به عنوان مثال اریتماتوسوس لوپوس سیستمیک)^[۱] یا مخصوص به بافت (به عنوان مثال دیابت ملی لوتوس) بروز می کند. این طبقه بندی هر چند از نظر کلینیکی سودمند می باشد اما نمی تواند از نظر عوامل ایجاد کننده تفکیک کننده باشد. سیستم تقسیم بندی سودمندتر سیستمی خواهد بود که اطلاعات کلی در رابطه با انتخاب، تنظیم یا مرگ سلول های T یا سلول های B، و نیز واکنش های به انتی ژن ها، خودی یا بیگانه ، باعث خود ایمنی می گردد[۴].

فاکتور های خطر ژنتیکی

بروز بیماری خود ایمنی به ترکیبی از فاکتور های ژنتیکی و محیطی بستگی دارد. بسیاری از بیماری های خود ایمنی به نظر می رسد پلی ژنی بوده و بیش از یک ژن در آن دخیل می باشد. تعداد کمی از بیماری های خود ایمنی از قبیل سندرم خود ایمن لیمفوپرولیفراتیو و سندرم اتوایمن اکتودرمال دیسپلازیا ناشی از جهش در یک ژن می باشند. در چنین شرایطی ژن های دیگر شدت بیماری را تعدیل می کنند و همه ی ژن هایی که تحت تاثیر جهش قرار می گیرند منجر به بیماری نمی شوند[۷].

بسیاری از بیماری های خود ایمنی چند ژنی بوده و ژنهای مستعد با همکاری های منسجم منجر به بروز فنوتیپ های غیر نرمال می شوند. در کل، چند شکلی ها در افراد سالم هم بروز می کنند و با عملکرد سیستم ایمنی طبیعی سازگار می باشند. فقط وقتی این جهش ها در ژنهای حساسیت رخ می دهند باعث واکنش خود ایمنی می شوند[۸].برخی از این ژنها سطح بالایی از خطر را نسبت به دیگری بروز می کنند برای مثال کمپلکس های هیستوکامپاتیبیلیتی نقش مهمی را در حساسیت به بیماری دارد. بسیاری از بیماری های خود ایمنی به مولکول های هلای کلاس یک و دوی ویژه مرتبط می باشد اما این ارتباط ممکن است با ژن های دیگری مانند فاکتور الفای کد کننده نکروز توموری یا TNF-α نیز لازم است لینک شود انتی ژن لیمفوسیت انسان یا هاپلوتایپ HLA بهترین پیشگو کننده  برای نمو یک بیماری خود ایمنی می باشد. [۸].

فاکتور های محیطی

فاکتور های محیطی ممکن است نقش های مختلفی در تسریع، ایجاد و تعدیل بیماری های خود ایمنی داشته باشند. هنگامی که فاکتور های محیطی ویژه ای در یک بیماری خود ایمنی نقش داشته باشند ممکن است شروع بیماری را تشخیص داد طبیعت بروز بیماری و یا حتی می توان فاکتور تعیین کننده روی این که ایا یک بیماری خود ایمنی موجود در یک فرد ممکن است بروز کند یا نه را مشخص کرد [۹].

فاکتور های محیطی یکی از مهمترین شروع کننده های تعیین کننده زمان و نوع بیماری خود ایمنی در زمان بروز می تواند باشد. نوع بیماری در یک فرد در یک بیماری خود ایمنی فامیلی با استفاده از ترکیبی خاص از فاکتور های مختلف عفونی، شیمیایی، دارویی و واکسن ها تعیین می شود[۹].

هورمون ها: بسیاری از بیماری های خود ایمنی در زنان بیشتر از مردان شیوع دارد. مطالعات نشان داده که نزدیک ۸۰ درصد از افراد با بیماری خود ایمنی زن می باشند. استثنائات شامل دیابت ملیتوس، اسپندیلیتیس انکیلوسن^[۲] و بیماری التهابی قلب می باشد. هورمونها از منابع خارجی مانند رژیم ها (سبوس)، داروها (قرص های کنترل بارداری) یا تولیدات پوستی بعلاوه استروئید های تولید شده بوسیله بدن می باشند. هورمون های جنسی مستقیما با سلول های سیستم ایمنی با استفاده از گیرنده های موجود در سطح واکنش می دهند. مشخص شده است که هورمون های استروئید ی تولید انتی بادی ها و تکثیر سلول های ایمنی را تحت تاثیر قرار می دهند. بنابراین هورمون ها می تواند واکنش ایمنی را مهار یا تکثیر کند [۹].

فهرست مطالب

فصل اول کلیات…. ۱

۱-۱) بیماریهای خود ایمنی… ۲

۱-۱-۱) کلیاتی از سیستم ایمنی.. ۲

۱-۱-۲) دسته بندی بیماری های خود ایمنی.. ۵

۱-۱-۳) فاکتور های خطر ژنتیکی.. ۵

۱-۱-۴) فاکتور های محیطی.. ۶

۱-۱-۵) اسیب ناشی از انتی بادی.. ۷

۱-۱-۶) اسیب های با واسطه سلول. ۸

۱-۲) بیماری بهجت…. ۸

۱-۲-۱) ویژگی های کلنیکی.. ۹

۱-۲-۱-۱) زخم های دهانی.. ۱۰

۱-۲-۱-۲) زخم های جنیتال. ۱۰

۱-۲-۱-۳) بروز چشمی.. ۱۱

۱-۲-۱-۴) عوارض پوستی.. ۱۲

۱-۲-۱-۵) عوارض عصبی.. ۱۲

۱-۲-۲) پاتوژنز بیماری بهجت… ۱۳

۱-۳) شبکه اندوپلاسمی و استرس ER… 15

۱-۳-۱) پیام رسانی واکنش پروتئین های تانشده ۲۰

۱-۳-۱-۱) IRE1. 22

۱-۳-۱-۲) PERK. 27

۱-۳-۱-۳) ATF6. 31

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده ۳۵

۲-۱)مروری بر تحقیقات انجام شده ۳۵

فصل سوم: مواد و روش ها ۴۳

۳-۱) فهرست مواد مورد استفاده ۴۳

۳-۲) فهرست تجهیزات مورد استفاده ۴۵

۳-۳) نمونه گیری از خون بیماران.. ۴۶

۳-۴)آماده سازی محلول ها ۴۶

۳-۴-۱) تهیه محلول PBS.. 46

۳-۴-۲) آماده سازی FBS.. 47

۳-۴-۳) تهیه تریپان بلو ۴/۰ درصد. ۴۷

۳-۴-۴) تهیه محیط کشت RPMI 47

۳-۴-۵) تهیه محیط کشت کامل.. ۴۸

۳-۴-۷) تهیه محلول PBS/BSA 1%.. 48

۳-۴-۸) تهیه بافر MACS. 48

۳-۵- روشهای مورد استفاده و مراحل انجام پژوهش….. ۴۹

۳-۵-۲) شمارش سلول ها با لام نئوبار. ۵۰

۳-۵-۳) جداسازی مونوسیت ها به روش MACS. 51

۳-۵-۴) شناسایی مونوسیت  ها با روش فلوسایتومتری.. ۵۱

۳-۵-۵) کشت سلول. ۵۲

۳-۵-۶) کشت مونوسیت و متمایز شدن آن به ماکروفاژ. ۵۳

۳-۵-۷) بررسی موروفولوژی ماکروفاژهای حاصل.. ۵۳

۳-۵-۸) استخراج RNA از ماکروفاژ ها ۵۳

۳-۵-۹) سنتز cDNA.. 55

۳-۶) طراحی آغازگر. ۵۵

۳-۸)واکنش Real time PCR.. 57

۳-۹) تجزیه و تحلیل داده‌ها ۵۸

فصل چهارم: نتایج.. ۵۹

۴-۱) کشت مونوسیت و متمایز شدن آن به ماکروفاژ. ۵۹

۴-۲) نتایج استخراج RNA… 60

۴-۳) واکنش Real time PCR.. 61

۴-۴) بررسی بیان ژن های هدف…. ۶۳

۴-۴-۱) بیان ژن ATF4. 63

۴-۴-۲) بیان ژن ATF6. 64

۴-۴-۳) بیان ژن BIP.. 65

۴-۴-۴) بیان ژن Chop. 66

۴-۴-۵) بیان ژن Gadd34. 67

۴-۴-۶) بیان ژن HERP.. 68

۴-۴-۷) بیان ژن XBP1. 69

فصل پنجم: بحث ونتیجه گیری… ۷۰

۵-بحث…. ۷۱